数字PCR技术DPCR Tech+ 查看更多
数字PCR被称为“第三代PCR技术”,其最大的特色是将单个核酸分子分配到独立的反应室,经过PCR扩增反应和荧光信号检测,实现单分子定量。数字PCR技术不依赖Ct值和标准曲线,同时具有极高的灵敏度、准确度和极佳的重复性,是超越实时荧光PCR的一种绝对定量分析技术。
数字PCR技术与生俱来的优势:1)能够检测稀少的珍贵样本;2)能够检测成分复杂的样本;3)能够减少PCR抑制剂的影响。这些优势拓宽了数字PCR在体外诊断领域的应用。
1. SNV检测
单核苷酸位点变异(SNV),包括常见的点替换、插入或缺失。肿瘤精准医学的伴随诊断中,常常可以检测到肿瘤驱动基因的点变异,如TP53 R175H,EGFR L858R,KRAS G12V,NRAS Q61R,BRAF V600E等。二代测序技术的灵敏度可达到1%,在检测的数据量上优势很大,但在检测一些背景信号很高或变异频率很低的样本时比较乏力。数字PCR的灵敏度为0.01%,甚至0.001%,对于千分之几级别的低频突变不仅可以检测到,而且能够精确定量。
在“精准医疗”风行的今天,微创或无创的“液态活检”也渐渐替代了“组织活检”,占了上风。实际上,常用的体液样本(如血液、胸腹水、尿液等)中游离DNA(cfDNA)很少,而ctDNA更少,只占约1%。如此微量的核酸,NGS灵敏度不足以精确检测,而数字PCR却可以通过微液滴处理,在每个微液滴中有效减少正常体细胞DNA的干扰,检测到痕量ctDNA。
2. CNV检测
除了SNV之外,异常的拷贝数变异(CNV)也是许多人类疾病(如癌症、遗传病、心血管疾病)发生的重要分子机制。数字PCR的“微分”技术,摆脱对Ct值的依赖,直接获取靶基因的绝对拷贝数,其检测精度远超二代测序、芯片杂交等技术平台。因此,数字PCR技术可以对NGS、aCGH的实验结果进行有效验证,作为其真实性的二次确认。同时,CN评估的主要技术瓶颈是如何在统计置信度下有效区分连续的CN。随着CV增加,目标遗传物质之间的差异百分比下降,使得CNV的检测更加困难。数字PCR系统通过在上万个微液滴中进行CNV特定片段的扩增反应,能实现对高连续拷贝数(例如5 vs 6, 甚至10 vs 11)的区分。
3. 基因融合检测
非小细胞肺癌患者中,一小部分会检测到ALK融合;不吸烟的肺腺癌患者中,ROS1融合则比较多见。临床上检测基因融合,一般使用免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和逆转录RT-PCR的方法。IHC简便易行,但灵敏度低,假阴性高,阳性判读标准因人而异。FISH作为检测的金标准,灵敏度和特异性高,但仍有较高的假阴性概率;不仅耗时长,对操作和判读的要求也很高。RT-PCR具有快速简单的特点,但因样本降解或污染也存在一定的假阳性和假阴性。数字PCR的高灵敏度、高准确度特点,加之对干扰的耐受力,可实现融合基因的精确定量。
4. CRISPR
“基因编辑”的概念随着CRISPR-Cas9技术受热捧而被大众熟知,最近更是因为“首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿”而变得炽手可热。但CRISPR-Cas9技术尚未达到百分百的成功率,基因编辑常常存在不可预期的“脱靶”效应。如何验证基因编辑的成功性,NGS在灵敏度上力有未逮,而数字PCR技术则可以大显身手。据悉,Broad研究所张锋团队发明了以CRISPR为基础的SHERLOCK技术,能够对核酸进行高灵敏度的定性检测,但对基因编辑效率精确定量评估时仍采用了数字PCR技术。
5. NGS验证和文库定量
NGS测序公司通常使用Qubit或荧光qPCR对NGS文库进行定量。Qubit对异源双链DNA不具有辨别力,荧光qPCR受染料的影响比较大,定量依赖扩增的效率,两者精度都不及ddPCR。除此之外,ddPCR还能获取样本的定性信息,提高NGS的成功率,并对NGS的结果进行验证。
6. 病毒载量绝对定量
病毒载量是指单位血浆中含有的游离病毒RNA拷贝数,该指标可以提示病毒感染者所处的时期、判定疾病的进展、监测抗病毒药物的疗效,还可观察耐药性问题。普通的检测手段如逆转录PCR,不能对其精确定量,或可引起对患者状况的误判。而利用数字PCR则可以对病毒载量进行绝对定量,避免后续的问题。
7. 无创产前诊断
产前诊断从侵入性的羊膜穿刺术、绒毛取材术到无创产前诊断(NIPT),技术的发展带来了便利,减轻了孕妇的痛苦也避免了流产的发生。目前基于NGS平台的NIPT所能检测到的项目(13、18、21三体综合征等),受限于平台的低精确度。数字PCR的高灵敏度和精准度是未来应用于NIPT的良好基石。据报道,数字PCR已在脊髓性肌萎缩、血友病、镰刀型贫血等遗传病的无创产前诊断中显示出了卓越的性能。
8. miRNA精确定量
miRNA是一类长约22nt的非编码RNA,能够调控基因表达、调节细胞功能,并且受到外泌体的保护而稳定地存在于外周循环中,有望成为癌症早期检测的生物标志物。目前血液样品miRNA的分析测试主要依赖qPCR,但研究发现,血清或血浆中的miRNA qPCR测量结果出现了极高的差异性,因此,qPCR的方法不能作为血液miRNA的稳定检测标准。qPCR与数字PCR的比较实验表明,数字PCR技术不仅重复性好,准确性和可信度也更高。
9. 多重PCR
在同时检测多种病原微生物或进行基因分型时,通常需要设计多重PCR。目前市面上的双色荧光数字PCR采取的策略是,通过调整荧光素浓度和两种荧光素的配比,来进行多达10重的PCR实验。对于新出现的四色荧光数字PCR而言,客户的PCR设计空间更大,结果的区分度也更佳。
总体而言,数字PCR技术放宽了对检测样本的要求,但并不意味着降低了对实验反应体系的要求。恰恰相反,数字PCR一定要使用专业设计的探针引物和专业配制的试剂体系,才能够实现最佳的定量分析表现。
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